“為何先進的基因檢測仍找不出病因？”臨床實踐中，醫生可能會遭遇到患者或家屬發出的這類質疑。特別是當部分患者的基因檢測報告可能顯示“陰性”結果，或檢測結果難以完全解釋患者臨床癥狀時，質疑聲會越發高漲。這類患者的病因，可能與基因組中一個長期以來研究相對有限的基因組“暗區”——非編碼區有關。
如果基因是一本書，外顯子就是書中直接傳達故事情節的文字，而非編碼區則是段落間的空白。傳統觀念認為，只有“文字”才承載信息。然而，現代遺傳學發現，這些“空白”區域同樣藏著關鍵指令，一旦出錯也會導致疾病發生。
人類非編碼基因組中的功能元件[1]
被忽視的基因組“暗區”：非編碼區
在人類基因組中，編碼蛋白質的外顯子區域僅占約2%，而非編碼區域占據了98%。20世紀末至21世紀初，部分研究曾將非編碼區稱為“垃圾DNA”，但實際情況并非如此。
非編碼區主要包括內含子、調控元件（如啟動子、增強子）、非編碼RNA基因及染色體結構區域（如端粒、著絲粒）等。在遺傳病致病變異研究中，除經典的外顯子變異及近剪接位點變異（指距離外顯子-內含子邊界±2bp內的變異）外，越來越多研究發現了致病的深度內含子變異（指距離剪接位點50個堿基以上的DNA序列改變）。這類變異可能通過多種機制致病：
? 創造新的剪接位點，導致異常“假外顯子”插入成熟mRNA；
? 破壞正常的剪接增強子或沉默子；
? 影響基因的調控元件；
? 改變非編碼RNA的功能。
典型案例：破解苯丙酮尿癥家庭的“第二變異”之謎
一對夫婦曾生育一個苯丙酮尿癥患兒（現年7歲）。該患兒既往在外院經全外顯子組測序（WES），僅檢出母源性致病變異（位于PAH基因11號外顯子區域），但始終未能明確第二致病等位基因。
為了評估家族再生育風險，患者接受了迪安診斷增強型全外顯子組測序技術（擴展覆蓋深度內含子區域）復測。除了再次確認患兒攜帶母源PAH基因11號外顯子區域的致病性雜合變異以外，突破性檢出了父源性深度內含子變異（位于PAH基因10號內含子區域），明確了該患兒病因，為夫婦再生育提供精準遺傳咨詢指導。
全外顯子組測序技術（擴展覆蓋深度內含子區域）檢測結果
傳統檢測的盲區：為什么WES或靶向基因Panel，會遺漏這些變異？
臨床常用的全外顯子組測序 (WES) 或者靶向基因Panel，主要針對外顯子編碼區域設計，其技術原理決定了它在檢測非編碼區變異方面存在天然局限：
# 捕獲探針覆蓋不足
常規WES探針主要靶向外顯子編碼區及鄰近剪接位點，對深度內含子區域、啟動子、增強子等非編碼區域捕獲效率極低。
# 同聚物區域測序偏差
如腺嘌呤、鳥嘌呤等連續重復的同聚物區域易出現測序錯誤。
# 結構變異識別困難
大片段缺失/插入的斷點常位于非編碼區，WES因短讀長特性無法跨越斷點區域，難以精確定位。
#注釋信息缺乏
現有數據庫中收錄的變異，集中于編碼區，對非編碼區變異的功能注釋不足，限制了非編碼區致病變異的解讀。
如何照亮基因組“暗區”？
面對非編碼區致病變異對臨床診斷帶來的挑戰，我們可以采取多層次的解決方案：
1 擴展捕獲探針
在WES檢測探針中針對性補充已知致病非編碼區的捕獲探針，提升基因組“暗區”變異的檢出率。
2 RNA-seq補充
RNA-seq需結合DNA測序結果，重點分析異常剪接事件或差異表達基因。
3 WGS策略
對臨床高度懷疑單基因病，但WES檢測結果為陰性的患者，可補充全基因組測序 (WGS) 策略。
4 功能驗證
對WES或WGS檢出的可能影響剪接的變異，可進行minigene剪接實驗等功能實驗驗證。
隨著基因組學技術的進步，我們正逐步揭開基因組“暗區”的神秘面紗。非編碼區不再是理論上的概念，而是具有實實在在臨床診斷價值的區域。對這些區域的拓展檢測，可能是解開疑難病例診斷之謎的關鍵密碼，將為疑難未確診患者帶來新的希望。
迪安診斷采用創新性的探針設計思路，將非編碼區已知致病性變異補充進多項遺傳病檢測探針中，助力遺傳病的精準診斷和個性化健康管理。
迪安診斷涉及非編碼區致病變異的檢測項目
參考文獻
1. French JD, Edwards SL. The Role of Noncoding Variants in Heritable Disease. Trends Genet. 2020 Nov;36(11):880-891. Epub 2020 Jul 31）
2. Turner TN, Hormozdiari F, Duyzend MH,et al. Genome Sequencing of Autism-Affected Families Reveals Disruption of Putative Noncoding Regulatory DNA. Am J Hum Genet. 2016 Jan 7;98(1):58-74. Epub 2015 Dec 31
3. Carss KJ, Arno G, Erwood M, Stephens J, et al. Comprehensive Rare Variant Analysis via Whole-Genome Sequencing to Determine the Molecular Pathology of Inherited Retinal Disease. Am J Hum Genet. 2017 Jan 5;100(1):75-90. Epub 2016 Dec 29
4. Bertoli-Avella AM, Beetz C, Ameziane N, Rocha ME, et al. Successful application of genome sequencing in a diagnostic setting: 1007 index cases from a clinically heterogeneous cohort. Eur J Hum Genet. 2021 Jan;29(1):141-153. Epub 2020 Aug 28
5. Lord J, Oquendo CJ, Wai HA, et al. Noncoding variants are a rare cause of recessive developmental disorders in trans with coding variants. Genet Med. 2024 Dec;26(12):101249. Epub 2024 Sep 3
